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高效液相色譜柱的沖洗步驟有哪些
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更新時間：2026-10-07
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沖洗前準備，確認色譜柱的固定相類型、耐受pH范圍以及保存溶劑，反相柱與正相柱沖洗溶劑存在差異，避免選用不匹配溶劑損傷填料。準備色譜級溶劑，提前超聲脫氣，檢查管路、過濾器無堵塞。記錄柱壓基線，作為沖洗前后的對比參考。停止樣品進樣，先將流動相中含有的緩沖鹽置換，鹽類殘留結晶會劃傷填料，造成柱效快速下降。
置換緩沖鹽，若流動相含有磷酸鹽、醋酸鹽等緩沖鹽，不能直接切換高比例有機相。使用低有機相比例的水溶液，一般純水或者5%至10%甲醇水溶液，以較低流速沖洗色譜柱，沖洗體積不少于10倍柱體積，直到管路和柱子內的緩沖鹽全部被沖出，壓力穩定，完成鹽相置換。禁止緩沖鹽直接接觸高濃度有機相，防止鹽析出堵塞色譜柱。
沖洗殘留樣品，鹽沖洗完成后，逐步提升有機相比例，按照梯度方式升高有機相濃度，沖洗柱子內吸附的強保留樣品組分。反相色譜柱常用甲醇或者乙腈，持續沖洗10至20倍柱體積，觀察基線，待基線平穩、無雜峰、壓力穩定，代表樣品殘留基本沖洗干凈。對于強吸附、高保留樣品，可適當延長沖洗時間，不可驟然大幅度改變流動相比例。
轉換保存溶劑，沖洗干凈樣品之后，將流動相切換為色譜柱規定的保存溶劑。C18這類反相柱通常使用80%甲醇或者乙腈水溶液；正相柱一般用正己烷或者異丙醇；親水色譜柱按照說明書要求選用保存液。以正常流速沖洗5至10倍柱體積，保證柱內溶劑替換為保存溶劑。
停泵與拆卸，溶劑置換完成，維持穩定柱壓一段時間，確認基線無異常，緩慢降低流速，最后關閉泵電源。等待管路壓力回落至常壓，拆卸色譜柱，兩端立刻擰緊柱堵頭，防止填料風干，避免空氣進入柱體。
沖洗后檢查與記錄，查看沖洗后的系統壓力，對比初始壓力，如果壓力明顯升高，說明存在殘留污染，需要再次沖洗。記錄沖洗時間、使用溶劑、柱壓情況，做好色譜柱使用臺賬。
不同色譜柱注意要點，正相色譜柱不能用水相溶劑長時間沖洗，防止固定相水解損壞；離子交換柱沖洗需要嚴格控制pH，逐步過渡溶劑；手性色譜柱溶劑切換速度要更平緩，避免破壞手性固定相。
通用操作禁忌，沖洗流速不可超過色譜柱最大允許流速，防止高壓沖擊造成填料塌陷。嚴禁使用超出pH耐受范圍的溶劑沖洗。沖洗過程避免壓力劇烈波動。如果柱子長期未使用，啟用前也需要按照上述流程緩慢平衡。
日常維護提示，每次測試結束都需要執行沖洗流程，樣品基質復雜時，適當增加沖洗體積。沖洗溶劑必須使用色譜純，減少雜質在柱內累積。